Россия
  • Россия
  • Украина
Укр

Биофарма-Амплисенс-Пцр-Вич Монитор

Виробник: ЗАТ «Трудовий колектив Київського підприємства з виробництва бактерійних препаратів "Біофарма".
Форма випуску:

«Рібо-сорб-12» для виділення РНК з клінічного матеріалу:

Склад

Тест-система складається з трьох комплектів реагентів:

«Рібо-сорб-12»

Комплект реагентів для виділення РНК з плазми крові;

«RT-PCR-ВІЛ»

Комплект реагентів для проведення зворотної транскрипції РНК ВІЛ 1 (метод ЗТ) і ампліфікації отриманої ДНК (метод ПЛР);

«ГіФА-96»

Комплект реагентів для гібридизаційно-ферментного аналізу ампліфікованої ДНК.

Упаковка

«Рібо-сорб-12»

Комплект реагентів для виділення РНК з клінічного матеріалу.

Реактив:

Лізуючий розчин – 1 флакон по 5,8 мол;

Розчин для відмивання 1 – 1 флакон по 8,0 мл;

Розчин для відмивання 3 – 1 флакон по 15,0 мл;

Розчин для відмивання 4 – 1 флакон по 8,0 мл;

Сорбент – 1 пробірка по 0,4 мл;

РНК-елюент-ВІЛ – 1 пробірка по 0,5 мл;

НКЗ (негативний контрольний зразок) – 1 пробірка по 0,5 мл;

ПКЗ-1-ВІЛ (позитивний контрольний зразок 1) – 1 пробірка по 0,01 мл;

ПКЗ-2-ВІЛ (позитивний контрольний зразок 2) – 1 пробірка по 0,01 мл;

В

Умови та терміни зберігання

«RT-PCR-ВІЛ» для проведення зворотної транскрипції РНК ВІЛ 1 (метод ЗТ) і ампліфікації отриманої ДНК (метод ПЛР):

 

Реактив Об'єм (мл) Кількість
RT-PCR-mix 0,3 1
Ревертаза (AMV) 0,013 1
Полімераза (Taq) 0,013 1

Комплект розрахований на 12 реакцій.

Комплект зберігати при температурі від 2 до 80С. Фермент AMV-ревертазу зберігати і транспортувати при мінус 18±20С.

«ГіФА-96» для гібридизаційно-ферментного аналізу ампліфікованої ДНК:

 

Реактив Об'єм (мл) Кількість
Денатуруючий розчин 1,0 1
Гібридизаційний буфер (ГБ) 10,0 1
Кон'югатний буфер (КБ) 10,0 1
Кон'югат 0,12 1
Відмиваючий буфер (ВБ), п'ятикратний 100,0 2
Субстрат ТМБ 10,0 1
Зупиняючий розчин 10,0 1
Планшет, сенсибілізований ДНК-зондами до ВІЛ і ВКЗ 1 шт

Комплект розрахований на проведення 12 кількісних визначень, включаючи контролі.

Комплект зберігати при температурі від 2 до 80С. Планшет, сенсибілізований зондами, зберігати при мінус 18±20С. Транспортування планшету проводиться протягом доби при температурі від 2 до 8ºС.

Матеріали й устаткування.

Для виділення РНК з клінічного матеріалу – ЗОНА 1:

  • стерильна ламінарна шафа («БОВ-001-АМС», м. Міасс, Росія або аналог);
  • твердотільний термостат для пробірок типу «епендорф» на 25–100ос (наприклад, «ТЕРМО-24», фірми «Біоком», Росія або аналог);
  • мікроцентрифуга для пробірок типу «епендорф» до 12 тис. g («Elmi», Латвія, «Hettish», “Mini-Spin”, Eppendorf, Німеччина або аналог);
  • центрифуга/вортекс («Micro-Spin», «Minigen», Німеччина, «ТЭТА-2», фірми «Біоком», Росія або аналог);
  • окремий набір автоматичних піпеток перемінного об'єму (наприклад, «Ленпіпет» або аналог);
  • одноразові поліпропіленові пробірки, що загвинчуються або щільно закриваються кришками на 1,5 мл (наприклад, «Axygen», США або аналог);
  • одноразові наконечники для піпеток перемінного об'єму з аерозольним бар'єром до 200 і до 1000 мкл (наприклад, фірми «QSP», США або аналог);
  • одноразові наконечники для піпеток перемінного об'єму до 200 мкл (наприклад, «Ленпіпет», Росія, «QSP», США або аналог);
  • штативи для наконечників, мікропробірок на 1,5 мл («Ленпіпет», «Хелікон» або аналог);
  • холодильник на 2–8 оС і на мінус 20 оС;
  • ємність з дезинфікуючим розчином;
  • одноразовий халат і одноразові гумові рукавички.

Для проведення зворотної транскрипції й ампліфікації (ПЛР) – ЗОНА 2:

  • настільний бокс з бактерицидною лампою (наприклад, «Циклотемп», фірми СП «РТС», Росія або аналог) або стерильна ламінарна шафа («БОВ-001-АМС», м. Міасс, Росія або аналог);
  • ампліфікатори «GeneAmp PCR System 2400», «GeneAmp PCR System 2700», фірми «Applied Biosystems», США; «Palm Cycler» фірми «Соrbett Research», Австралія або аналог;
  • одноразові поліпропіленові пробірки для ампліфікації на 0,2 мл (наприклад, «QSP», «Axygen”, США або аналог);
  • одноразові наконечники для піпеток перемінного об'єму з аерозольним бар'єром до 100 мкл, вільні від РНКаз (наприклад, «QSP», США або аналог);
  • окремий набір автоматичних піпеток перемінного об'єму (наприклад, «Ленпіпет», Росія або аналог);
  • штативи для наконечників, мікропробірок на 0,2 мол (наприклад, «Ленпіпет», «Хелікон», Росія або аналог);
  • холодильник на плюс 4 оС і на мінус 20 оС для збереження реактивів і РНК;
  • ємність для скидання наконечників;
  • комплект засобів для обробки робочого місця;
  • одноразовий халат і одноразові гумові рукавички.

Для гібридизаціонно-ферментного аналізу ампліфіцированої ДНК – ЗОНА 3:

  • холодильник на 2–8 0С з морозильною камерою на мінус 20 0С;
  • термостат плашечний на 37 0С (наприклад, iEMS, “Labsystem”, Фінляндія або аналог);
  • окремий халат і одноразові гумові рукавички;
  • мірний циліндр на 1 літр;
  • окремий набір одноканальних автоматичних піпеток перемінного об'єму (наприклад, «Ленпіпет», Росія або аналог);
  • окремий набір восьмиканальних автоматичних піпеток перемінного об'єму (наприклад, «Ленпіпет», Росія або аналог);
  • плашечний спектрофотометр (наприклад, "Мультіскан", "Уніскан", Латвія або аналог);
  • вошер (не обов'язково);
  • наконечники для автоматичних піпеток (наприклад, «Ленпіпет», Росія або аналог).

Підготовка до аналізу.

Збирання і збереження зразків.

Матеріалом для дослідження служить плазма крові.

Одержання плазми крові.

Збирання крові проводиться натще з ліктьової вени одноразовою голкою (діаметр 0,8–1,1 мм) в одноразову пластикову пробірку з антикоагулянтом (3% розчин ЕДТА в співвідношенні 1:20) або спеціальну вакуумну систему типу «Venoject» (з ЕДТА), «Vacuett®». Гепарин як антикоагулянт використовувати не можна! Пробірка закривається кришкою і перевертається кілька разів (для перемішування з антикоагулянтом). Плазму крові одержують центрифугуванням цільної крові (800–1600 g протягом 20 хв). Потім відбирають плазму окремими наконечниками з аерозольним бар'єром у стерильні пробірки типу «Епендорф» на 1,5 мл. Для виділення РНК використовується 100 мкл зразка плазми.

Зберігати плазму крові можна не більше 3 діб при температурі від 2 до 8°С, протягом 1 року – при температурі мінус 70 °С.

Допускається тільки одноразове заморожування-відтаювання матеріалу. При заморожуванні клінічного матеріалу його транспортування повинне проводитися в замороженому стані.

Запобіжні заходи.

Необхідне суворе дотримання правил облаштування, техніки безпеки, виробничої санітарії, протиепідемічного режиму й особистої гігієни при роботі в лабораторіях (відділеннях, відділах) санітарно-епідеміологічних установ.

Працюють тільки в одноразових рукавичках, використовують і змінюють при кожній операції одноразові наконечники для автоматичних піпеток з аерозольним бар'єром. Одноразовий пластиковий посуд (пробірки, наконечники) повинен скидатися в спеціальний контейнер, що містить дезинфікуючий 0,2% розчин ДП-2Т, 10%-ний розчин хлорного вапна, 5%-ний розчин хлораміну Б або 1 N розчин соляної кислоти.

Аналіз проводиться в три етапи в трьох окремих приміщеннях (зонах).

Усе лабораторне устаткування, у тому числі піпетки, штативи, лабораторний посуд, а також усі робочі розчини повинні бути виключно стаціонарними. Забороняється їх перенос з одного приміщення в інше. Переміщення персоналу з кімнати для детекції продуктів ПЛР в інші приміщення заборонено.

Поверхні столів, а також приміщення, у яких проводиться постановка ПЛР, повинні обов'язково до початку і після початку робіт опромінюватися ультрафіолетовим світлом.

Проведення аналізу.

ЕТАП 1. Виділення РНК з клінічних проб

Проводиться в ЗОНІ-1 – кімнаті для обробки клінічного матеріалу.

Порядок роботи.

1. Лізуючий розчин прогріти при температурі від 60 до 65 оС до повного розчинення кристалів. Дати охолонути розчину до кімнатної температури.

2. Для виділення РНК із 12 проб, включаючи контролі, у баночку з лізуючим розчином додати стерильним наконечником з бар'єром 50 мкл внутрішнього контрольного зразка (ВКЗ). Баночку ретельно перемішати.

Увага! Суміш лізуючого розчину з ВКЗ зберігається не більш 2 годин.

3. Лізис клінічного матеріалу. Узяти пробірки на 1,5 мл, які щільно закриваються кришкою, для обробки необхідної кількості проб і контролів, промаркувати. При проведенні аналізу необхідно поставити один негативний контроль і два позитивних контролі (ПКЗ-1) і (ПКЗ-2). У кожну пробірку окремим наконечником додати 450 мкл підготовленої суміші лізуючого розчину з ВКЗ.

4. У кожну пробірку додати по 0,1 мл досліджуваної плазми, закрутити кришку і перемішати на вортексі. Осадити на центрифузі для скидання крапель рідини з кришки.

5. Підготовка негативного контролю етапу виділення РНК (НК) У пробірку з лізуючим розчином додати 0,1 мл негативного контрольного зразку (НКЗ), перемішати на вортексі й осадити краплі рідини з кришки.

6. Підготовка першого позитивного контролю етапу виділення РНК (ПКЗ-1) У пробірку з лізуючим розчином додати 0,09 мл НКЗ і 10 мкл позитивного контрольного зразка 1 (ПКЗ-1), перемішати на вортексі й осадити краплі рідини з кришки.

7. Підготовка другого позитивного контролю етапу виділення РНК (ПКЗ-2) У пробірку з лізуючим розчином додати 0,09 мл НКЗ і 10 мкл позитивного контрольного зразка 2 (ПКЗ-2), перемішати на вортексі і осадити краплі рідини з кришки.

8. Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі. У кожну пробірку окремим наконечником додати по 25 мкл ресуспендованного сорбенту . Перемішати на вортексі, залишити на 10 хв при кімнатній температурі, ретельно перемішуючи кожні 2 хв.

9. Процентрифугувати пробірки для осадження сорбенту при 10 тис. g протягом 30 сек на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний відсмоктувач і окремий наконечник для кожної проби.

10. Додати в пробірки по 0,5 мл розчину для відмивання 1 . Перемішати на вортексі до повного ресуспендування сорбенту. Центрифугувати пробірки на мікроцентрифузі при 10.000 g протягом 30 сек. Відібрати надосадову рідину з кожної пробірки окремим наконечником, використовуючи вакуумний відсмоктувач.

11. Додати в пробірки по 0,5 мл розчину для відмивання 3 . Перемішати на вортексі до повного ресуспендування сорбенту. Центрифугувати пробірки на мікроцентрифузі при 10.000 g протягом 30 сек. Відібрати розчин для відмивання 3 з кожної пробірки окремим наконечником, використовуючи вакуумний відсмоктувач.

12. Повторити відмивання розчином для відмивання 3.

13. Додати в пробірки по 0,5 мл розчину для відмивання 4 . Перемішати на вортексі до повного ресуспендування сорбенту. Центрифугувати пробірки на мікроцентрифузі при 10.000 g протягом 30 сек. Цілком відібрати розчин для відмивання 4 з кожної пробірки окремим наконечником, використовуючи вакуумний відсмоктувач.

14. Висушити сорбент, помістивши пробірки в термостат на 560С на 10 хв з відкритими кришками.

15. Ресуспендувати сорбент у 40 мкл РНК-елюенту-ВІЛ . Прогріти в термостаті при 650С 5 хвилин, перемішати на вортексі й осадити сорбент на центрифузі при 10.000 g протягом 2 хвилин.

РНК-проби готові до постановки полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскрипцією.

Реакцію зворотної транскрипції варто проводити відразу після одержання РНК-проби. Відбирати розчин РНК для реакції потрібно дуже обережно, не захоплюючи сорбент . Якщо сорбент скаламутився, необхідно осадити його на центрифузі.

ЕТАП 2. Постановка полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскрипцією

Проводиться в ЗОНІ 2 – кімнаті для розкапування реагентів і проведення ПЛР-ампліфікації. Загальний об'єм реакційної суміші – 50 мкл, об'єм РНК-проби – 25 мкл.

Порядок роботи:

Увага! При роботі з РНК необхідно використовувати тільки одноразові стерильні пластикові видаткові матеріали, що мають спеціальне маркірування «RNase-free», «DNase-free».

1. Відібрати необхідну кількість мікропробірок на 0,2 мл.

2. Фермент AMV-ревертазу перемішати і відкрутити на вортексі, щоб осадити краплі з кришки і стінок пробірки.

3. Приготувати реакційну суміш на 12 реакцій: у пробірку з 2-кратним реакційним буфером ( RT-PCR-mix ) додати 13 мкл ферменту ревертази AMV (10 од/мкл) і 13 мкл Taq-полімерази (5 од/мкл), ретельно перемішати.

4. Внести в мікропробірки по 25 мкл готової реакційної суміші.

5. Використовуючи наконечник з бар'єром, додати 25 мкл готової РНК-проби в пробірку з реакційною сумішшю, обережно перемішати піпетуванням.

6. Поставити пробірки в ампліфікатор GeneAmp PCR System, закрити кришку ампліфікатора ( При додаванні РНК-проб необхідно уникати попадання сорбенту в реакційну суміш для ПЛР ).

7. Запустити на ампліфікаторі нижчезазначену програму:

 

Ампліфікатори з активним регулюванням (по розчину в пробірці): “ GeneAmp PCR System 2700”, (Perkin Elmer) Ампліфікаторі з активним регулюванням (по розчину в пробірці): “ GeneAmp PCR System 2400”, (Perkin Elmer), Palm Cycler (Соrbett Research)
цикл температура час цикли температура час цикли
1 42 0С 30 хв 1 42 0С 30 хв 1
2 95 0С 2 хв 1 95 0С 2 хв 1
3 95 0С 40 сек 5 95 0С 20 сек 5
52 0С 40 сек 52 0С 20 сек
72 0С 40 сек 72 0С 20 сек
4 95 0С 40 сек 21 95 0С 20 сек 21
55 0С 40 сек 55 0С 20 сек
72 0С 40 сек 72 0С 20 сек
5 72 0С 1 хв 1 72 0С 1 хв 1
6 10 0С збереження 10 0С збереження

Після закінчення реакції зібрати пробірки в спеціальний штатив і відправити в кімнату для аналізу продуктів ПЛР (ЗОНУ 3). Допускається збереження ампліконів при температурі від 2 оС до 8 оС не більш 2-х днів. Аналіз продуктів ампліфікації проводиться гібридизаційно-ферментним методом.

ЕТАП 3. Гібридизаційно-ферментний аналіз ампліфікованої ДНК

Проводиться в ЗОНІ 3 – кімнаті для аналізу продуктів ампліфікації.

Робота з ампліфікованими ДНК повинна проводитися в окремій кімнаті співробітниками лабораторії, що не проводять маніпуляцій у зоні 1 і зоні 2.

Підготовка реагентів для гібридизації на плашках:

1. Готують однократний відмиваючий розчин, для цього до 200 мл п'ятикратного відмиваючого буфера додають 800 мл стерильної деіонізованої води, зберігають при кімнатній температурі протягом 1 дня.

2. Кон'югат розводять буфером для кон'югату (кон'югатний буфер) безпосередньо перед використанням або не більш ніж за 2 години, для цього в баночку з кон'югатним буфером додають 110 мкл кон'югату і ретельно перемішують.

Увага! При розкапуванні гібридизаційного і кон'югатного буфера, ТМБ і зупиняючий розчин у лунки планшета необхідно їх додавати безпосередньо на дно лунки, не торкаючись наконечником її стінок.

Порядок роботи:

1. У пробірки з ампліфікованими пробами розкапати по 50 мкл денатуруючого розчину і перемішати піпетуванням, залишити на 10 хв при кімнатній температурі.

2. Гібридизаційний буфер розкапати у лунки планшета з імобілізованими зондами по 100 мкл , накрити планшет кришкою або заклеїти захисною плівкою. Прогріти 10 хв при температурі 37 0С у термостаті для планшетів.

3. Додати в лунки ряду А планшета з прогрітим гібридизаційним буфером по 25 мкл денатурованих проб за допомогою багатоканальної піпетки, перемішати піпетуванням 15 разів і зробити п'ятикратну титровку до ряду F, піпетуючи в кожному ряді не менш 10 разів. Після піпетування в лунках ряду F 25 мкл видаляють. Потім у лунки ряду G додати по 25 мкл денатурованих проб і зробити п'ятикратну титровку в лунки ряду H. З ряду H 25 мкл видаляють. Накрити планшет кришкою або захисною плівкою і поставити при температурі 37 0С у термостат для планшетів на 1 годину. (Лунки планшета рядів A-F покриті зондом, специфічним ВІЛ; лунки рядів G-H покриті зондом, специфічним ВКЗ).

4. Видалити гібридизаційний буфер з лунок і промити 5 разів однократним відмиваючим розчином, заливаючи його в кожну лунку по 200 мкл, щораз ретельно видаляючи його залишки.

5. Додати в лунки по 100 мкл розведеного кон'югату , накрити планшет кришкою або захисною плівкою і поставити при температурі 37 0С у термостат для планшетів на 20 хв.

6. Видалити кон'югат з лунок і промити 5 разів однократним відмиваючим розчином, заливаючи його в кожну лунку по 200 мкл, щораз ретельно видаляючи його залишки.

7. Додати в лунки по 100 мкл субстрату ТМБ . Поставити в темне місце на 10 хвилин.

Увага! ТМБ варто наносити безпосередньо на дно лунки, не торкаючись наконечником її стінок.

8. Реакцію зупиняють, додавши в лунки по 100 мкл зупиняючого розчину.

9. Облік результатів роблять спектрофотометрично при довжині хвилі 450 нм безпосередньо в планшетах на фотометрах типу "Мультіскан", "Уніскан" і т. п.

Облік результатів.

Для кожного з досліджуваних і контрольних зразків концентрацію РНК ВІЛ розраховують у такий спосіб:

1. Вибирають лунки, покриті зондом, специфічним для ВІЛ (ряди від А до F), у яких оптичний сигнал має мінімальне значення в діапазоні 0,35 – 2,0 ОО.

2. Розраховують загальну оптичну щільність для ВІЛ-амплікона, множачи обране значення на відповідний фактор розведення (1, 5, 25, 125, 625, 3125):

 

Ряд Фактор розведення
А 1
У 5
З 25
D 125
E 625
F 3125

3. Вибирають лунки, покриті зондом, специфічним для ВКЗ (ряди G і H), у яких оптичний сигнал має мінімальне значення в діапазоні 0,35 – 2,0 ОО.

4. Розраховують загальну оптичну щільність для ВКЗ, множачи обране значення на відповідний фактор розведення (1, 5):

 

Ряд Фактор розведення
G 1
H 5

5. Для розрахунку концентрації РНК ВІЛ у плазмі крові для кожного з досліджуваних і контрольних зразків загальну оптичну щільність ВІЛ ділять на загальну оптичну щільність внутрішнього контрольного зразка і множать на коефіцієнт, представлений на окремому вкладиші:

Загальна оптична щільність ВІЛ

Х коефіцієнт = копії РНК ВІЛ/мл.

Загальна оптична щільність внутрішнього стандарту

Коефіцієнт, представлений на вкладиші (число копій РНК ВКЗ/мл плазми), специфічний для кожного лота.

Лінійний діапазон виміру тест-системи: 500–800.000 копій РНК/мл. Якщо результат більше ніж 800.000 копій/мл, то він видається як результат більше 800.000 копій/мл.

Якщо результат менше ніж 500 копій/мол, то він видається як результат менше 500 копій/мл.

При одержанні значення вище 800.000 копій/мл зразок може бути перетестований після десятикратного розведення негативною плазмою; отриманий результат множать на 10.

При одержанні значення менше 500 копій/мл зразок плазми може бути перетестований після попереднього центрифугування в такому режимі: 1,0 мл плазми крові центрифугують при 25.000 g або більш протягом 1 години при температурі від 2оС до 8 0С, акуратно відбирають 900 мкл супернатанту, далі аналіз проводять за вищеописаною схемою, а отриманий результат ділять на 10.

Результати аналізу не підлягають обліку в таких випадках:

  • Відсутність закономірного зниження оптичного сигналу в процесі титрування амплікона: потрібна перестановка даної проби.
  • Оптичний сигнал для внутрішнього контрольного зразка в п'ятикратному розведенні нижче 0,35 ОО: потрібна перестановка даної проби.
  • Оптичний сигнал для негативного контрольного зразка вище 0,35 ОО: потрібна перестановка всієї панелі.
  • Результати за позитивними контрольними зразками повинні вкладатися в діапазон, зазначений на вкладиші. Якщо отримані значення не вкладаються в заданий діапазон, потрібна перестановка всієї панелі.

Знезаражування.

Знезаражування біоматеріалу і реагентів варто проводити на кожній стадії окремо, поміщаючи одноразовий пластиковий посуд (пробірки, наконечники), колби-пастки вакуумних відсмоктувачів на 20 – 24 години в спеціальні контейнери, що містять дезинфікуючий 0,2% розчин ДП-2Т, 10%-ний розчин хлорного вапна, 5%-ний розчин хлораміну Б або 1 N розчин соляної кислоти.

Умови і терміни зберіння. Комплекти «РІБО-сорб-12» (крім РНК-елюента-ВІЛ), «RT-PCR-ВІЛ» (крім AMV-ревертази) і «ГіФА-96» (крім планшета) зберігаються при температурі від 2 до 8 0С. РНК-елюент-ВІЛ, ревертаза і планшет зберігаються при температурі мінус 18±20С.

Термін придатності – 6 місяців.